Detección de polimorfismos de nucleótido simple en el Lolium perenne
Se evaluaron distintos métodos para la detección de polimorfismos de nucleótido simple (SNP) como parte de un programa de cultivo de hierbas basado en marcadores de SNP. Los criterios evaluados fueron el rendimiento, la fortaleza/reproducibilidad, el contenido informativo y la rentabilidad de los costes. En total, los científicos de GRASP evaluaron nueve técnicas diferentes para detectar y describir SNP relacionados con características específicas. En opinión de tres de los socios del consorcio, el sistema más idóneo era el Sequenom MassARRAY. Dicho sistema se basa en espectrometría de masas tipo MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization - Time-Of-Flight, o desorción/ionización mediante láser asistida por matriz y asociada a un analizador de tiempo de vuelo), gracias a la cual el genotipado es completamente automático. Se trata de una técnica potente, flexible y de gran rendimiento que permite identificar las variaciones genéticas con precisión. Además, es fácil de usar y su coste es rentable. Los genotipos obtenidos se separaron con arreglo a la masa y todos los ensayos se diseñaron por ordenador. De este modo se pudo analizar varios puntos de SNP independientes en un único ensayo de tipaje y no fue necesario emplear etiquetas fluorescentes. Los investigadores emplearon dos métodos distintos para secuenciar los alelos y detectar los haplotipos y SNP en veinte genotipos de Lolium perenne. El primero consistió en clonar y secuenciar no menos de cinco fragmentos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) por cada par de genotipo y gen candidato. El segundo método consistió en una secuenciación directa de haplotipos específicos con la que se obtuvieron las secuencias del ADN de ambos alelos.
