Rilevamento del polimorfismo a singolo nucleotide del loglio
Sono stati valutati diversi metodi per il rilevamento dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) nell'ambito di una strategia di selezione basata sul marcatore SNP per le piante erbacee. I criteri valutati includevano capacità produttiva, robustezza/riproducibilità, contenuto informativo ed efficienza in termini di costi. In generale, gli scienziati del progetto GRASP hanno valutato nove diverse tecniche per il rilevamento e l'identificazione degli SNP specifici dei caratteri. Inoltre, tre dei partner del consorzio hanno indicato il sistema Sequenom MassARRAY come il più adatto. Il sistema usa una spettrometria di massa a ionizzazione/desorbimento laser assistita da matrice a tempo di volo (MALDI-TOF), che ha fornito una genotipizzazione completamente automatizzata. La tecnica era una tecnologia potente, flessibile e ad elevate prestazioni in grado di identificare con precisione le variazioni genetiche. Era anche facile da usare ed economica. I genotipi sono stati separati in base alla massa e tutti i saggi sono stati progettati al computer. Ciò ha consentito di analizzare diversi siti SNP indipendenti in un singolo saggio di tipizzazione, rendendo superfluo l'uso della marcatura fluorescente. I ricercatori hanno usato due diversi metodi per effettuare il sequenziamento degli alleli e rilevare gli aplotipi e gli SNP in 20 genotipi di loglio perenne. Il primo metodo prevedeva la clonazione e il sequenziamento di almeno cinque frammenti di reazione a catena della polimerasi (PCR) per ogni combinazione di genotipo e gene candidato. Il secondo metodo utilizzava il sequenziamento aplotipo-specifico diretto, ottenendo sequenze di DNA da entrambi gli alleli.
