Semplificare il sequenziamento del DNA
Sviluppato nel 1977, il sequenziamento del DNA con metodo di Sanger imita il processo naturale della sintesi del DNA per leggere le sequenze di piccole regioni di DNA. Negli ultimi 10 anni sono nate tecnologie superveloci, collettivamente denominate sequenziamento di nuova generazione (Next Generation Sequencing, NGS), che consentono il sequenziamento di più frammenti di DNA a velocità più elevate e costi molto ridotti. In sostanza, grazie al NGS è come se si potessero eseguire una serie di piccole reazioni di sequenziamento Sanger in parallelo. Nonostante questi progressi, rimane difficile sequenziare in modo soddisfacente molte regioni genomiche di rilevanza medica e agricola.
La microfluidica nell’analisi genomica
L’iniziativa IMPACT, finanziata dall’UE, è nata con l’obiettivo di superare le principali sfide associate ai flussi di lavoro della genomica attualmente in uso. «Il nostro obiettivo era consentire l’analisi di regioni genomiche che sono inaccessibili con altre tecnologie», spiega Marie Just Mikkelsen, direttrice tecnica e co-fondatrice di Samplix. Il team di IMPACT ha sviluppato un approccio basato sulla microfluidica (Xdrop®) in grado di incapsulare materiale biologico, quale il DNA, in goccioline a doppia emulsione altamente stabili per l’analisi genomica a valle. Il flusso di lavoro inizia con la cattura delle molecole di DNA nelle goccioline e successivamente la sequenza di rilevamento che si riferisce alla regione interessata viene amplificata utilizzando la reazione a catena della polimerasi (letteralmente «PCR digitale a gocce»). La sequenza amplificata ha un segnale fluorescente che consente lo smistamento delle goccioline con il target desiderato, che viene poi ulteriormente arricchito utilizzando la tecnica di amplificazione di spostamento multiplo a goccia (dMDA). Xdrop® supporta l’analisi di campioni a bassa concentrazione di DNA, fornendo materiale adatto a letture di sequenze sia lunghe che corte. In particolare, è in grado di catturare lunghe regioni di DNA consentendo l’identificazione e l’indagine di inserzioni, delezioni, ripetizioni e interruzioni nella regione genomica di interesse. Ciò è particolarmente importante per le regioni genomiche implicate nelle malattie. È anche in grado di recuperare singole molecole di DNA da una quantità minima di campione biologico, quale le biopsie tumorali.
Applicazioni e prospettive di IMPACT
«Comprendere le esigenze degli utenti è fondamentale nello sviluppo di nuove tecnologie», sottolinea Mikkelsen. I partner di IMPACT hanno investito tempo ed energie nell’interazione con gli utenti, visitando le loro strutture per ottenere un prezioso feedback che ha portato all’ottimizzazione di Xdrop® per una serie di applicazioni. La tecnologia è stata impiegata con successo in progetti di editing genomico, dove si è dimostrata in grado di individuare le modifiche genomiche così come le variazioni non intenzionali. Inoltre, sono emersi risultati interessanti da progetti che utilizzano Xdrop® per studiare i geni del cancro e i cluster di geni biosintetici nel genoma dell’orzo. La tecnologia è anche adatta a risolvere regioni genomiche sconosciute in piante e animali. «Nel complesso, Xdrop® ha dimostrato una notevole versatilità e si prevede che avrà un impatto duraturo nei campi della genomica e della biologia cellulare», conclude Mikkelsen. Lo strumento ha la capacità di incapsulare singole molecole, organuli o cellule in goccioline a doppia o singola emulsione, aprendo nuove possibilità di analisi a valle. Le attività proseguono tuttora concentrandosi sullo sviluppo di ulteriori servizi basati su Xdrop® e sul supporto agli utenti che stanno studiando nuove applicazioni. Il team sta anche lavorando a nuove possibilità per migliorare ulteriormente il flusso di lavoro, mantenendo la natura intuitiva della tecnologia.
Parole chiave
IMPACT, Xdrop®, sequenziamento del DNA, microfluidica, analisi genomica, sanità, reazione a catena della polimerasi a gocce, amplificazione di spostamento multiplo a goccia