Uproszczone sekwencjonowanie DNA
Opracowana w 1977 roku metoda sekwencjonowania DNA Sangera odwzorowuje naturalny proces syntezy tej cząsteczki i umożliwia odczytanie sekwencji w jej krótkich fragmentach. W ostatniej dekadzie byliśmy świadkami rozwoju ultraszybkiej technologii o zbiorczej nazwie „sekwencjonowanie następnej generacji” (ang. next-generation sequencing, NGS), która nie tylko umożliwia o wiele szybsze sekwencjonowanie wielu fragmentów DNA, ale jest także nieporównywalnie tańsza. Metody NGS stanowią rozwinięcie technologii Sangera, gdyż umożliwiają jednoczesne, masowe sekwencjonowanie małych fragmentów DNA. Pomimo wprowadzenia tak znaczących udoskonaleń, skuteczne odczytanie sekwencji wielu regionów genomu o dużym znaczeniu dla medycyny czy rolnictwa wciąż nastręcza licznych trudności.
Zastosowanie mikrofluidyki w analizie genomu
Finansowana ze środków UE inicjatywa IMPACT miała na celu rozwiązanie kluczowych wyzwań związanych z ustalonym przebiegiem reakcji. „Chcieliśmy przeanalizować te regiony genomu, które są niedostępne dla innych technologii”, wyjaśnia Marie Just Mikkelsen, dyrektor technologiczna i współzałożycielka firmy Samplix. Zespół projektu IMPACT opracował podejście oparte na mikrofluidyce o nazwie Xdrop®, które umożliwia analizę genomu dzięki enkapsulacji materiału biologicznego, np. DNA, w wysoce stabilnych kroplach emulsji podwójnej. W pierwszym etapie procesu badacze zamykają cząsteczki DNA w kroplach, a następnie dokonują amplifikacji wybranej sekwencji odnoszącej się do interesującego ich regionu na drodze reakcji łańcuchowej polimerazy opartej o technologię kropelkową (kropelkowy PCR). Wzmocniona sekwencja posiada sygnał fluorescencyjny ułatwiający sortowanie kropli zawierających pożądany produkt DNA, który podlega następnie dalszemu wzmocnieniu metodą wielokrotnej amplifikacji przemieszczeniowej opartej o technologię kropelkową (dMDA). Technologia Xdrop® opiera się na analizie próbek DNA o niskim stężeniu i dostarcza materiał odpowiedni do odczytu zarówno długich, jak i krótkich sekwencji. Co istotne, dzięki możliwości enkapsulacji długich fragmentów DNA metoda Xdrop® pozwala na identyfikację i badanie insercji, delecji, powtórzeń i ubytków w interesujących badaczy regionach genomu, co ma szczególne znaczenie w przypadku regionów powiązanych z występowaniem chorób. Technologia ta umożliwia ponadto pobieranie pojedynczych cząsteczek DNA z niewielkich próbek biologicznych, takich jak bioptaty guza.
Zastosowanie i perspektywy dotyczące rozwiązań IMPACT
„Szczegółowe poznanie potrzeb użytkowników ma kluczowe znaczenie dla rozwoju nowych technologii”, podkreśla Mikkelsen. Partnerzy inicjatywy IMPACT włożyli sporo czasu i wysiłku w rozmowy z użytkownikami – odbywali spotkania w ich rodzimych placówkach po to, by zbierać od nich bezcenne informacje zwrotne, na podstawie których optymalizowali technologię Xdrop® odpowiednio do zastosowania. Technologia została z powodzeniem wdrożona w ramach wielu projektów związanych z edycją genomu, wykazując wysoką zdolność do identyfikacji modyfikacji genów oraz niezamierzonych efektów edycji genomu. Projekty, w których wykorzystano technologię Xdrop® do badania genów raka i biosyntetycznych klastrów genów w genomie jęczmienia, przyniosły bardzo ciekawe wnioski. Jest ona również skuteczna w identyfikowaniu nieznanych regionów genomu roślin i zwierząt. „Tym co wyróżnia technologię Xdrop® jest jej uniwersalność, dlatego sądzimy, że będzie miała istotny wpływ na rozwój dziedzin takich jak genomika czy biologia komórki”, podsumowuje Mikkelsen. Dzięki swojej zdolności enkapsulacji pojedynczych cząsteczek, organelli i komórek w kroplach emulsji prostej i podwójnej, otwiera wiele nowych możliwości analizy. Badacze koncentrują się obecnie na opracowaniu dodatkowych usług opartych na technologii Xdrop® i wspieraniu użytkowników, którzy testują nowe zastosowania. Zespół pracuje także nad dalszym usprawnieniem poszczególnych etapów reakcji sekwencjonowania, starając się jednocześnie zachować przyjazny charakter swojej technologii.
Słowa kluczowe
IMPACT, Xdrop®, sekwencjonowanie DNA, mikrofluidyka, analiza genomowa, opieka zdrowotna, reakcja łańcuchowa polimerazy oparta o technologię kropelkową, wielokrotna amplifikacja przemieszczeniowa oparta o technologię kropelkową
