Molekuły identyfikatorowe nanoporów
Uczestnicy projektu GENOTYPING NANOPORES (Genotyping using solid-state nanopores and pepetide nucleic acid markers – a new tool for single-molecule molecular diagnostics) stworzyli rewolucyjną, tanią metodę genotypowania pojedynczej molekuły bazującą na nanoporowej detekcji peptydów kwasów peptydonukleinowych (PNA). Analiza nanoporowa polega na użyciu napięcia do kierowania molekuł poprzez nanopory w membranie między elektrolitami. Możliwe są pomiary zmian natężenia prądu podczas przepływu pojedynczych molekuł przez nanopor. Naukowcy projektu GENOTYPING NANOPORES wykazali już wcześniej, że istnieje możliwość wykrywania PNA przy użyciu nanoporów w stanie stałym. Obecnie ulepszyli oni produkcję nanoporów, stosunek sygnału do szumu podczas pomiarów oraz strategie biomolekularne efektywnego przechodzenia PNA przez nanopor. W celu zwiększenia specyficzności detekcji, naukowcy użyli sond γPNA o wysokim powinowactwie do DNA. Wyniki pokazują, że prąd jonowy odpowiadający przejściu dwuniciowego DNA z przyłączonymi trzema molekułami γPNA charakteryzuje się trzema odrębnymi cechami. Umożliwia to prostą identyfikację i analizę ilościową molekuł DNA, w miarę jak przechodzą przez pory. Badacze skalibrowali odległość w parach zasad między dowolnymi dwiema molekułami PNA. Następnie zidentyfikowali w czasie rzeczywistym i sklasyfikowali geny dwóch podtypów HIV wykazujących ponad 92% podobieństwo. Metoda klasyfikacji nanoporowej umożliwia szybki i dokładny podział oraz analizę ilościową obu wariantów HIV. Rozszerzając to podejście w końcowej fazie projektu, badacze stworzyli bardziej uniwersalną metodę kodowania paskowego DNA. Użyto emitujących światło sond, tzw. "molecular beacons", do nadawania kodu barwnego specyficznym sekwencjom. Fluorofory kolejnych sond typu "beacon" emitują fotony po rozwinięciu struktury, które są następnie wykrywane przez czułe mikroskopy. Ta procedura jest kompatybilna z jednoniciowym DNA (ssDNA) oraz molekułami ssRNA. Została ona opisana w prestiżowym czasopiśmie naukowym Nano Letters, 15, 745-752, 2015. Wydaje się, że wpływ na społeczeństwo będzie ogromny: metoda może mieć liczne praktyczne zastosowania na polu biomedycznym. Oprócz wczesnej detekcji nowotworów w krążącym DNA guza, metody te mogą być użyte do szybkiej identyfikacji antybiotykoopornych patogenów i optymalizacji podawania antybiotyków. Dalszy rozwój tej technologii pozwoli zbudować tanie, przenośne i wysokoprzepustowe urządzenie do wszechstronnej diagnostyki genomicznej.
Słowa kluczowe
Nanopor, sekwencjonowanie DNA, kwas peptydonukleinowy, kodowanie paskowe DNA, sondy molekularne typu Molecular Beacon