ID-Moleküle von Nanoporen
Im Rahmen des Projekts GENOTYPING NANOPORES (Genotyping using solid-state nanopores and pepetide nucleic acid markers – a new tool for single-molecule molecular diagnostics) ist eine revolutionäre, kostengünstige Methode für die Genotypisierung von Einzelmolekülen entwickelt worden, die auf der Nanoporenerkundung von Peptid-Nukleinsäuren (PNA) basiert. Zur Nanoporenanalyse muss eine Spannung angelegt werden, um die Moleküle durch nanoskalige Poren in einer Membran zwischen zwei Elektrolyten zu leiten. Es können Stromveränderungen gemessen werden, wenn einzelne Moleküle durch die Nanopore laufen. Die Wissenschaftler von GENOTYPING NANOTYPES hatten zuvor gezeigt, dass PNA durch winzige Festkörper-Nanoporen nachweisbar sind. Sie haben nun die Nanoporenfertigung, den Störabstand der Messungen und die biomolekularen Strategien für eine effiziente PNA-Invasion der Nanopore verbessert. Für die hochpräzise Abtastung verwendeten die Wissenschaftler γPNA-Sonden für eine hohe DNA-Affinität. Die Ergebnisse zeigen, dass das Ionenstromsignal, das dem Durchgang eines doppelsträngigen DNA-Moleküls entspricht, an dem drei γPNA Moleküle gebunden wurden, drei verschiedenen Funktionen entspricht. Dies ermöglicht eine einfache Identifizierung und Quantifizierung der DNA-Moleküle, wenn sie durch die Pore translozieren. Die Forscher kalibrierten den Abstand zwischen zwei beliebigen PNA-Molekülen in Basenpaaren. In Echtzeit identifizierten und klassifizierten sie Gene in den beiden HIV-Subtypen, die eine Ähnlichkeit von mehr als 92% aufwiesen. Das Nanoporen-Klassifizierungsverfahren ergab eine schnelle und sehr genaue Unterscheidung und Quantifizierung der zwei HIV-Varianten. Durch eine Erweiterung des Ansatzes in der finalen Phase des Projekts entwickelten die Forscher eine allgemeinere DNA-Barcoding-Methode. Über die Verwendung Licht emittierender „molekularer Beacons“ zur farbigen Markierung sequenzenspezifischer Proben emittiert das Fluorophor des nächsten Beacons beim Entpacken Photonen, die über ein empfindliches Mikroskop erfasst werden. Dieses Verfahren ist mit einsträngigen DNA (ssDNA)- und mit ssRNA-Molekülen kompatibel und wurde in der renommierten Fachzeitschrift Nano Letters, 15, 745-752, 2015 veröffentlicht. Es zeichnen sich vielversprechende Auswirkungen auf die Gesellschaft ab, die mannigfaltige Möglichkeiten für eine praktische Anwendung im Bereich der Biomedizin eröffnen. Abgesehen von der Krebsfrüherkennung bei zirkulierender Tumor-DNA können diese Methoden zur schnellen Identifizierung von Pathogenen für die antimikrobielle Resistenz zur Optimierung der Antibiotikaverabreichung genutzt werden. Die Weiterentwicklung der Technologie beinhaltet ein kostengünstiges, portables Gerät mit hohem Durchsatz, um ein breites Spektrum genomischer Diagnostik zu ermöglichen.
Schlüsselbegriffe
Nanopore, DNA-Sequenzierung, Peptid-Nukleinsäuren, DNA-Barcoding, Molecular Beacons