Kleine Proteine helfen bei der Erforschung zellulärer Aktivitäten
Guanosin-Triphosphatasen (GTPasen) der Rho-Familie sind kleine Proteine, die intrazelluläre Prozesse auf verschiedenen Ebenen wie Zellproliferation, Apoptoseverhalten und Genexpression regulieren. Cdc42, Rac1 und RhoA sind drei dieser Proteine, die für eine gesunde menschliche Entwicklung sorgen und Krankheiten verhindern, vorausgesetzt, sie funktionieren ordnungsgemäß. Eine wichtige Gruppe von Proteinen aus der Familie der Rho-GTPasen sind GEF-Proteine (Rho-Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor), von denen viele im menschlichen Genom exprimiert werden und die Aktivierung von Rho-GTPasen stimulieren. Ziel des Projekts "RhoGEFs in epithelia" (The role of RhoGEFs in epithelial polarity using a three-dimensional model) war eine unverzerrte, umfassende funktionelle Analyse aller Rho-GEF-Proteine, um GEF-Proteine der Rho-Familie zu identifizieren, die eine maligne Entartung von Epithelzellen begünstigen, wenn ihre Regulierung gestört wird. Die Funktion von Rho-GEF-Proteinen wird an einem MDCK-3D-System (MDCK: Madin-Darby Canine Kidney Cells – eine Gewebszellkultur) untersucht. Nachdem die Partner eine Bibliothek mit kurzen Haarnadel-RNAs (short hairpin RNA, shRNA) gegen Rho-GEF-Proteine erstellt hatten, generierten sie Viren, die anschließend gesammelt und gefiltert wurden, um damit MDCK-Zellen zu infizieren. Die infizierten Zellen wurden analysiert und ausplattiert, um Zysten zu bilden, und für spätere Untersuchungen fixiert und eingefärbt. Eine solche Vorbehandlung der Reagenzien war jedoch nicht zufriedenstellend, sodass die Partner sich für ein Kandidaten-Screening entschieden, um die Genexpression spezifischer, in MDCK-Zellen exprimierter GEF auszuschalten oder zu reduzieren. Der neue Ansatz bestätigte, dass ITSN2 (Cdc42 specific GEF Intersectin2) an der Regulierung der Cdc42-Aktivität beteiligt sein könnte, die die Lumenproduktion steuert. Unter dem Lumen versteht man das Innere einer tubulären Struktur, beispielsweise von ableitenden Harnwegen oder primären Harnleitern. Untersuchungen an Zellen, bei denen ITSN2 ausgeschaltet wurde, ergaben eine Reduzierung von Cdc42-GTP-Konzentrationen, was den aberranten Phänotypen bei der Entstehung maligner Zysten erklären könnte. Bestätigt wurde auch eine Lokalisation von ITSN2 an Zentrosomen, die für die Produktion von Mikrotubuli zuständig sind. Eine abnormale Anzahl von Zentrosomen wiederum wird häufig in Krebszellen nachgewiesen. Ferner zeigte sich, dass ITSN2 und Cdc42 für eine gesunde Zellteilung unentbehrlich sind.