Zmutowane enzymy przyspieszają procesy przemysłowe
W ramach finansowanego przez UE projektu "Xylanases as models for understanding enzymatic catalysis" (XYLANASES) wykorzystano powszechnie znane enzymy do zbadania roli odległych pozostałości w katalizie. Ksynalazy to glikozydazy wytwarzane przez grzyby, bakterie i drożdże, które rozkładają hemicelulozę, ważny składnik ściany komórkowej roślin. Są one najczęściej wykorzystywane w przemyśle papierniczym. Uczestnicy projektu postanowili zbadać, w jaki sposób odległe od siebie części enzymu wpływają na katalizę. Ksynalazy należą do enzymów najdokładniej scharakteryzowanych pod względem mechanicznym i strukturalnym, dzięki czemu są idealnymi systemami modelowymi do takich badań. Naukowcy badali udział konkretnych aminokwasów w katalizie, stosując kombinację mutagenezy, protein semisyntezy białek, kinetyki enzymów, magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) białek oraz krystalografii rentgenowskiej. Systematycznie wprowadzane mutacje wywoływały zmiany w strukturze i czynności enzymów. Efektem odległych mutacji aminokwasów w ksynalazie otrzymanej z Bacillus circulans była znacząca zmiana ekspresji i właściwości oczyszczających. Semisynteza białek została wykorzystana do wprowadzenia nienaturalnych aminokwasów. Po badaniach kinetycznych zmutowanych enzymów przeprowadzono analizę strukturalną przy pomocy NMR. Badania rentgenowskie pozwoliły na określenie trójwymiarowych struktur wybranych mutantów. Dzięki temu można było badać inaktywację i reaktywację mutantów w czasie rzeczywistym. W projekcie XYLANASES po raz pierwszy przeprowadzono in vivo specyficzną dla miejsca mutagenezę nienaturalnych aminokwasów w enzymie węglowodanowym. Aktywność mutantów zmieniła się od 8 do 55 razy w porównaniu z enzymem występującym w naturze. Mutacje wpływające na inaktywację i reaktywację enzymów różniły się między sobą. Badania strukturalne przy pomocy krystalografii rentgenowskiej powinny dostarczyć nowych informacji na temat modulacji inaktywacji. Uczestnicy projektu określili warunki odpowiednie do ekspresji białek, pozwalające uzyskać wystarczającą ilość białek zawierających nienaturalne aminokwasy do badań metodą krystalografii rentgenowskiej. Choć już wcześniej otrzymywano ksynalazę z Bacillus circulans, nie wytwarzano jednak białek krystalicznych zawierających nienaturalne aminokwasy. Dane pochodzące z krystalografii powinny pomóc w wyjaśnieniu zjawisk kinetycznych związanych z inkorporacją nienaturalnych aminokwasów aminokwasów w kluczowych pozycjach ksynalazy.
Słowa kluczowe
Enzym, mutacje enzymów, ksynalazy, kataliza enzymatyczna, Bacillus circulans
