Mutazioni enzimatiche per processi industriali più veloci
Il progetto XYLANASES (“Xylanases as models for understanding enzymatic catalysis”), finanziato dall’UE, ha usato degli enzimi comuni per studiare il ruolo dei residui remoti nella catalisi. Le xinalasi sono glicosidasi prodotte dai funghi, dai batteri e dai lieviti, che scompongono l’emicellulosa, un componente principale delle pareti cellulari delle piante. Le loro applicazioni commerciali sono più comuni nell’industria della carta. I membri del progetto miravano a capire come le parti remote di un enzima contribuissero alla catalisi. Le xinalasi sono fra gli enzimi meglio caratterizzati dal punto di vista strutturale e meccanico e costituiscono i sistemi modello ideali per tale ricerca. Gli scienziati hanno investigato la partecipazione di amminoacidi specifici nella catalisi usando una combinazione di mutagenesi, semisintesi proteica, cinetica enzimatica, risonanza magnetica nucleare (RMN) delle proteina e cristallografia a raggi X. Le mutazioni indotte sistematicamente hanno comportato cambiamenti nella struttura e nell’attività dell’enzima. Le mutazioni remote di amminoacidi nella xilanasi dal Bacillus circulans si sono tradotte in proprietà di purificazione ed espressione sostanzialmente alterate. La semisintesi proteica è stata usata per introdurre degli amminoacidi non naturali. Gli studi cinetici dei mutanti sono stati seguiti dall’analisi strutturale che utilizza la RMN. Gli studi radiografici hanno determinato le strutture 3D del mutante scelto. Era così possibile seguire l’inattivazione e la riattivazione dei mutanti in tempo reale. XYLANASES ha dimostrato per la prima volta in vivo la mutagenesi non naturale di amminoacidi sito-specifici su un enzima attivo sui carboidrati. L’attività dei mutanti è stata alterata da 8 a 55 volte rispetto all’enzima presente in natura. Le mutazioni che interessavano l’inattivazione e la riattivazione dell’enzima erano distinte l’una dall’altra. Si prevede che gli studi strutturali che sfruttano la cristallografia a raggi X forniscano la conoscenza nella modulazione dell’inattivazione. Il progetto ha stabilito le condizioni di espressione robuste della proteina che producono proteina sufficiente che incorpora degli amminoacidi non naturali per gli studi cristallografici a raggi X. Sebbene la xilanasi dal Bacillus circulans sia stata precedentemente cristallizzata, non è stata prodotta alcuna proteina di cristallo contenente amminoacidi innaturali. Si prevede che i dati della cristallografia aiuteranno a chiarire gli effetti cinetici dell’integrazione di amminoacidi innaturali nelle posizioni principali della xilanasi.
Parole chiave
Enzima, mutazioni enzimatiche, xilanasi, catalisi enzimatica, Bacillus circulans
