Un simulatore del fegato sorpassa le alternative basate sulla sperimentazione animale
Il fegato ha un ruolo fondamentale per trasformare e purificare le sostanze chimiche che assorbiamo ogni giorno e questo lo rende uno degli organi principali studiati nei test di tossicità. Gli scienziati stanno tuttavia ancora cercando il metodo migliore per effettuare tali test, che frequentemente coinvolge gli animali e quindi spesso non riesce a riflettere l’impatto reale delle sostanze chimiche testate sul fegato umano con un’affidabilità del 100 %. Per superare questo problema, il consorzio HEMIBIO si è proposto di sviluppare un dispositivo in grado di simulare la complessa struttura del fegato umano e di metterla a disposizione per i test pre-clinici di tossicità nell’ambito dell'iniziativa SEURAT-1. Adesso, un paio di mesi prima della fine del progetto, il team è riuscito a sviluppare un dispositivo di fegato su chip in grado di mantenere attivi dal punto di vista metabolico gli organoidi del fegato per oltre un mese in vitro, con una precisione del 99 % delle misurazioni delle concentrazioni tossiche. La prof.ssa Catherine Verfaillie, coordinatrice del progetto e direttrice dell’Istituto di cellule staminali della KU Leuven, presenta alcune delle principali scoperte del progetto e i piani del consorzio per il futuro. Come è nato il progetto HEMIBIO? HEMIBIO è nato da collaborazioni precedenti tra molti dei partecipanti al progetto (i dottori Verfaillie, Luttun, van Grunsven, Rogiers, Sancho-Bru, Collas, Nahmias e Van Fleteren), volte alla creazione di un modello in vitro del fegato umano per lo studio della tossicità e dell’epatite virale, nonché da studi relativi alla creazione di cellule del fegato parenchimatiche e non parenchimatiche associate usando piccoli bioreattori microfluidici. Poiché eravamo tutti molto interessati all’ingegnerizzazione del tessuto epatico, da un punto di vista di scienza applicata e di base, abbiamo visto HEMIBIO come un’opportunità di ampliare la nostra collaborazione in Europa e avere un impatto reale sullo sviluppo di alternative ai test di tossicità in vivo. Abbiamo reclutato partner eccellenti con competenze di biologia del fegato, tossicologia, ingegneria del genoma, tecnologia e microfabbricazione di sensori e abbiamo stilato una proposta che era molto più ampia rispetto alla somma delle sue parti. Perché pensa che sia necessario sostituire i test sugli animali? Quando abbiamo presentato la domanda per il progetto HEMIBIO erano stati finanziati diversi progetti dalla CE che avevano come obiettivo la riduzione del bisogno di usare gli animali nei testi di tossicità. Per una valutazione degli effetti tossici di un’esposizione cronica non solo ai farmaci ma anche alle sostanze chimiche e ai cosmetici però era ancora necessario ricorrere con relativa frequenza all’uso degli animali. Inoltre a parte le considerazioni etiche, c’era anche molto bisogno di cellule umane adatte da usare nei testi di tossicità, a causa della spesso scarsa concordanza osservata tra la tossicità nei modelli animali e gli effetti reali negli esseri umani. Qual era il vostro obiettivo principale? Credevano che, per ricreare un dispositivo che simulasse il fegato e che fosse adatto per i test di tossicità a lungo termine, i componenti cellulari del fegato dovessero essere utilizzabili per lunghi periodi di tempo (più di un mese), con un’appropriata funzione metabolica e di trasporto e una fisiologia paragonabile a un fegato in vivo. Per ottenere questo dovevamo tener conto del flusso attraverso il dispositivo, la zonazione degli epatociti (e alcune cellule epatiche non parenchimali), e l’impatto delle cellule non parenchimali sulla funzione e sulla tossicità a valle del componente parenchimale – in particolare quando riguardavano uno dei risultati tossici, fibrosi e cirrosi epatica. La fibrosi e cirrosi epatica è causata da un’interazione della tossicità degli epatociti e dell’attivazione delle cellule stellate del fegato che ha causato un deposito di collagene, insieme a cambiamenti delle cellule endoteliali sinusoidali del fegato che perdono la loro specifica membrana fenestrata. Tali cambiamenti possono essere studiati solo all’interno di un dispositivo nel quale siano presenti diversi componenti della cellula. Quali sono secondo lei i principali risultati del progetto fino a questo momento? HEMIBIO ha portato a cinque grandi progressi. In primo luogo, abbiamo sviluppato un dispositivo di fegato su chip in grado di mantenere attivi dal punto di vista metabolico gli organoidi del fegato per oltre un mese in vivo con gradienti di ossigeno che imitano il microambiente di origine. Questo dimostra i vantaggi specifici della tecnologia umana su chip, poiché i metodi attuali si basano su un’esposizione giornaliera a farmaci e a dozzine di analisi di punti finali – il che ha come risultato informazioni cinetiche e valore prognostico limitati. Un secondo risultato è stato la produzione di una collezione varia di colture polarizzate, funzionali dal punto di vista metabolico e proliferanti di epatociti umani primari – il punto di riferimento per gli studi di tossicità dei farmaci. Abbiamo mostrato che le cellule potevano prevedere con precisione il profilo TC50 [50% di concentrazioni tossiche] di 12 componenti con una precisione senza precedenti del 99% (rispetto al 60 % delle cellule HepG2/C3A). Abbiamo generato cinque diversi genotipi di pazienti di un ampio background etnico, il che permette di studiare la variabilità tra i pazienti e gli episodi di tossicità idiosincratica in grandi popolazioni. Un terzo risultato è stato la creazione, usando co-colture di epatociti e cellule stellate, di un modello in vitro unico per studiare la tossicità della dose ripetuta che ha come risultato finale la fibrosi epatica. Il quarto successo è lo sviluppo di cellule staminali pluripotenti ingegnerizzate dal punto di vista genomico – linee di cellule hPSC – adatte allo scambio di cassetta mediato dalla ricombinasi (RMCE) nel luogo genetico AAVS1 che permette la generazione di linee transgeniche entro 3-4 settimane con un’efficienza del 100 % e senza integrazioni casuali. Usando RMCE siamo riusciti a incorporare diversi transgeni utili per l’identificazione della discendenza, per studi di tossicità e sovra-espressione genetica. Infine HEMIBIO ha fornito una nuova definizione di trascrizionale, miRNA e fenotipo dell’epigenoma di cellule stellate del fegato umane quiescenti e attivate e nuovi sistemi di coltura per mantenere le cellule stellate umane quiescenti in vitro. Quando pensate che il vostro dispositivo potrebbe essere commercializzato? Il gruppo del prof. Nahmias presso l’Università ebraica di Gerusalemme, in collaborazione con l’Istituto Fraunhofer e Upcyte Technologies, ha dimostrato la capacità di espandere gli epatociti umani e sostenere la loro funzione in un bioreattore microfluidico per oltre 28 giorni in condizioni di continue misurazioni dell’ossigeno. Questa tecnologia di fegato su chip prevede in modo accurato i valori di TC50 di acetaminofene, amiodarone, troglitazone e rotenone, una serie di tossine sulla lista Gold Compound di Seurat-1, con un R2 di 0,9 in correlazione in vitro in vivo. La sensibilità del dispositivo ha permesso la rilevazione di un nuovo meccanismo di tossicità dell’acetaminofene e nuove informazioni sullo sviluppo dei danni provocati dal troglitazone. Diverse richieste di brevetti provvisorie sono state presentate per il bioreattore, i metodi e i sensori. Alcuni dei partner stanno prendendo in considerazione la possibilità di creare una società nei prossimi mesi che fornisca servizi di screening per l’industria cosmetica e farmaceutica. Inoltre, il gruppo The Verfaillie ha adesso creato una piattaforma iPSC per il vaglio dei farmaci, che nel prossimo futuro ci auguriamo sarà automatizzata, in modo da poter generare, differenziare e usare grandi numeri di linee, in vagli ad alto rendimento. È realistico pensare che questo potrebbe sostituire i test in vivo in un prossimo futuro? Siamo convinti che i progressi fatti nell’ambito di HEMIBIO contribuiranno alla possibilità di sostituire i test sugli animali con test in vitro, anche se tanti studi che si occuperanno della correlazione in vitro – in vivo saranno ancora necessari per sostituire completamente gli studi sugli animali con bioreattori caricati con cellule umane in vitro. Quali sono i vostri piani entro e dopo la conclusione del progetto? Diversi partner del consorzio HEMIBIO (e altri gruppi di Seurat-1) sono impegnati in schemi di finanziamento locali (van Grunsven, van de Water, Verfaillie), e in schemi di follow up EC-H2020 (Verfaillie, van de Water) e direttamente con aziende di cosmetica (Nahmias) su studi riguardanti la creazione di modelli di fegato in vitro per la tossicità. Questi dovrebbero in definitiva permettere di sostituire gli studi sugli animali con studi umani in vitro usando organoidi compositi del fegato in bireattori microfluidici. Quindi i progressi fatti nell’ambito di HEMIBIO saranno portati avanti in queste attività successive.
Paesi
Belgio