Strukturbiologiestudien: Kryogenik bekommt grünes Licht
Das 26S-Proteasom ist eine große Molekülmasse, die aus 35 Untereinheiten besteht. Obwohl die proteolytischen Kernpartikeln bereits ausgiebig erforscht wurden, weiß man über das regulatorische Partikel noch nicht allzu viel. Das EU-finanzierte Projekt "Subunit localisation of the Drosophila 26S proteasome by means of 3D cryo electron microscopy" (26S Proteasome) erforscht die Zusammensetzung der Untereinheiten des regulatorischen Partikels. Dazu verwendeten die Forscher verschiedene Techniken, um Untereinheiten zu kennzeichnen und ihre Position im 26S-Proteasom mithilfe der Einzelpartikel-Kryoelektronenmikroskopie (CEM) zu kartieren. Dies ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der dreidimensionalen (3D-) Organisation des Proteasoms. Allerdings ist die Auflösung noch nicht ausreichend, um Untereinheiten der regulatorischen Partikel voll zu erkennen und zuzuweisen. Während der ersten Phase des Projekts wurden drei chromatographische Schritte zur Reinigung des 26S-Proteasoms vor der Antikörpermarkierung durchgeführt. Eine Kernteilchen-Untereinheit und fünf Untereinheiten des regulatorischen Partikels wurden erfolgreich markiert. In der zweiten Phase konzentriert sich das 26S Proteasome-Projekt auf die Lokalisierung der Rpn10-Untereinheit, für die eine neue Reinigungs- und Markierungsmethode entwickelt werden musste. Die besondere Methode bietet Mittel zur Ein-Schritt-Affinitätsreinigung. Die Proteasomen werden mithilfe des spezifischen Interaktionspartners markiert. Projektmitglieder verwendeten biochemische Techniken, um die strukturelle Integrität, die proteolytische Aktivität und die Reaktionen der Untereinheit auf affinitätsisolierte und markierte Proteasomen zu analysieren, die anschließend zur Durchführung einer Einzel-Partikel-CEM-Analyse verwendet wurden. Dadurch erhielten die Forscher die Mittel, um die Anheftungsstelle des nuklear-angereicherten Proteins Dsk2 auf dem 26S-Proteasom-Komplex zu kartieren und schließlich die Rpn10-Untereinheit zu lokalisieren.